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1分子克隆实验——无缝克隆 今天和大家讲讲无缝克隆常见的问题以及解决方法。 1.平板上很少或者没有克隆菌落 建议使用试剂盒附带的阳性对照,可排除试剂盒本身的影响。进一步判定,主要有以下可能的情况和建议: 01载体制备 线性化载体和插入片段的纯度不够,抑制反应。 02插入片段制备 1、引物设计不正确:同源臂15~25nt(不计算酶切位点),CG含量40~60%。 2、线性化载体和插入片段的纯度不够,抑制反应。若线性化载体与插入片段已经过纯化,
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0采用“水上转盘法”建立大鼠全睡眠剥夺模型。本方法一是剥夺动物全部睡眠的方法,根据实验动物怕水的习性设计而成。剥夺装置主要由剥夺箱、转盘及转盘相连接的动力装置三部分组成。箱内盛水,转盘基座与箱底连接,周围注水,转盘高出水面,动物放在转盘上后,匀速转动。由于动物子啊睡眠状态时肌张力降低,离心作用使其掉入水中而惊醒,为避免掉入水中,动物必须不停活动,从而达到剥夺睡眠的目的。 模型制作方法: SD大鼠,体重140-1
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00102120现有实验室超过6000平米,还有3.3万实验室正在在建设中,北京周边实验基地,聚焦基础科研、动物模型、细胞模型、组学服务、生物信息学、基因检测、细胞增殖、细胞周期凋亡、细胞培养、病毒包装 ,稳定株情选、原代细胞分离、流式检测、平板克隆、划痕、侵袭江移、WB、蛋白抽提、蛋白定量、蛋白质纯化、蛋白双向电泳、明胶酶谱、定量PCR、荧光定量PCR服务、包埋切片爬片、免疫组化、免疫荧光等医学科学基础研究与转化医学的研究。08年至今0以1%戊巴比妥钠溶液(50mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。 将大鼠固定于手术台上,沿中线切开头皮挂线旷置。 手术显微镜下沿眶内缘小心分离左眶软组织,尽量向两眦延伸和视神经眶内段。 依照解剖层次分别牵开眼外肌肉,充分暴露眼球后极纵向切开视神经背侧鞘膜,注意避免伤及视网膜中央动脉。 在眼球后极1.5mm处以显微剪剪断视神经。10嗅球切除(olfactory bulbectomy,OBX)模型是较早建立并应用于抑郁症研究的动物模型,OBX后动物表现出空场活性增加、强迫游泳和悬尾不动时间增加和糖水偏爱下降等行为学特征。 一、实验动物 ♂SD大鼠,体质量100~140g,实验前在安静的环境下适应性饲养2周,自由进食、饮水,自然昼夜节律光照。 二、方法 采用探针捣毁嗅球与负压吸引相结合的方式切除嗅球制作大鼠嗅球切除抑郁症动物模型。 三、模型的建立 大鼠在手术前1周内,每日1~2次抚摸,至0为了确保Western Blot(WB)实验结果的有效性和可重复性,其中很重要的一点就是样本如何上样?通常,小伙伴们面临选择是以相同的蛋白量上样还是以相同的体积上样。每种方法都有其优势和局限性,但以等蛋白量上样通常被认为是更为严谨和科学的方法。这是因为蛋白质表达水平的变化对实验结果的解释至关重要,而等蛋白量上样可以较直接地反映这些变化。 等蛋白量上样可以比较不同样本中目标蛋白的相对含量,从而更准确地评估生物学变化或处0动物造模:大小手术模型 药物诱导模型 模型评价监测:行为学检测 影像检测 生化生理指标检测 细胞培养 细胞爬片 细胞转染 流式细胞术 慢病毒包装 细胞划痕 细胞迁移 细胞侵袭 稳定株筛选等 硬组织切片 包埋 切片 染色 特殊染色 免疫组化 免疫荧光 荧光定量PCR服务 miRNA检测 DNA定量 甲基化测序 质粒提取 质粒构造 菌种鉴定 慧星实验 引物合成等 蛋白质纯化 蛋白质电泳 单克隆抗体制备 原核表达 免疫沉淀 免疫共沉淀 SILAC标记定量蛋白质组学 ELISA检00000动物造模:大小手术模型 药物诱导模型 模型评价监测:行为学检测 影像检测 生化生理指标检测 细胞培养 细胞爬片 细胞转染 流式细胞术 慢病毒包装 细胞划痕 细胞迁移 细胞侵袭 稳定株筛选等 硬组织切片 包埋 切片 染色 特殊染色 免疫组化 免疫荧光 荧光定量PCR服务 miRNA检测 DNA定量 甲基化测序 质粒提取 质粒构造 菌种鉴定 慧星实验 引物合成等 蛋白质纯化 蛋白质电泳 单克隆抗体制备 原核表达 免疫沉淀 免疫共沉淀 SILAC标记定量蛋白质组学 ELISA检00养细胞这件事儿,看似简单,然而却常常因为各种原因,让我们珍贵的实验细胞一再受损或者die。 本期博主就结合多年实践经验和细胞培养指南, 为大家讲述细胞从复苏、传代到冻存等一系列过程及常遇到的那些你可能忽略的小却重要的细节。 1⃣细胞的营养来源 2⃣细胞的居住环境 3⃣细胞的复苏与冻存 4⃣细胞的传代培养 以及常见问题解答 满满的干货与tips ,欢迎大家👍收藏,一起讨论交流呀00定量PCR(qPCR)是一种在PCR反应中实时监测核酸扩增产物的方法。为什么qPCR提RNA不提DNA?RNA更能反映gene的表达水平 依据中心法则,细胞内的DNA序列首先被转录成RNA分子,特别是信使RNA(mRNA),随后mRNA携带遗传信息,用于指导蛋白质的合成。mRNA的丰度和多样性是衡量基因表达水平的关键指标,它们直接关联到特定基因在特定时间和条件下的活性。与蛋白质相比,RNA的水平变化能够更快地反映基因表达的动态变化,因为RNA的稳定性相对较低,其水平变1※什么是实验外包? 实验外包即将实验外包于独立科研机构之外的第三方实验室,已经成为发展趋势。 第三方实验室不仅实验设备先进,可操作实验的规模和种类也是多种多样,国家层面也出台政策推动科研单位与企业利用资源优势互补,提高科研效率。 ※为什么选择实验外包? 一,节省时间 实验周期长,耗费时间多,将实验外包可以节省大量时间。 二,节约费用 实验仪器繁多,价格昂贵,将实验外包可以节省实验设备采购,将有限的科研费用用00实验外包现在是越来越多人的选择了,大家也都从好奇,质疑走到了理解接受,这也是实验外包这个行业越来越被认可的原因,现在国家也鼓励资源最大化利用,高效科研,这也是这个行业壮大的原因之一 有人反馈说,现在是想要实验外包,但是不知道怎么找,不知道哪些比较靠谱,在此我想说的是——现在这个行业进入了发展的快车道,很多人都开始进入到这个行业,其中不乏毕业的博士生,实验器械公司,甚至还有刚毕业的大学生硕士生直接开10实验外包000SD大鼠,8周龄,雄性。实验室温度18-25°C,常规饲养,自由饮食。 运动方式与条件:无负重游泳,玻璃缸游泳池,水深约为大鼠体长的两倍,水温为30-32°C。 心理应激模型的制备:采用大鼠旁观电击模型,电击组的大鼠(电流1-2mA,周期100s,间歇90s)被电击惊叫、惊跳;心理应激模型组大鼠不受电击,只是旁观电击组大鼠受电击的过程,通过视觉、听觉等产生心理应激应激于实验末日分批进行,持续30min。 分组域实验控制包括:a、对照组:不运动,00QPCR 干粉引物溶解稀释的一般方法如下: 收到引物后,在开启离心管盖前,在3000-4000转/分钟的转速下离心1分钟,以防开盖时引物干粉散失。因为引物在干燥过程中,寡核苷酸在EP管底部形成白色片状沉淀。鉴于运输过程中沉淀会飘起,在打开管盖之前进行简短离心这一步骤至关重要。 引物保存在高浓度的状况下比较稳定。如果对实验的重复性要求较高,合成的 OD 数较大,建议分装,避免反复冻融。 引物一般配制成10-100umol/l。 引物的浓度可以通过以1载体 在Cohen和Boyer的实验中,两种质粒都能在E. coli中复制。因此,这两种质粒都可以作为载体,使重组DNA得以复制。所有基因克隆实验都需要这样的载体,我们称之为载体(Vector),但典型的基因克隆实验只涉及一个载体,以及一个依赖于载体进行复制的外源DNA片段。外源DNA没有复制起点,即DNA复制开始的地方,因此除非将其放入具有复制起点的载体中,否则它无法复制。自20世纪70年代中期以来,已经开发了许多载体;这些载体分为两大类:质粒(pl000在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定,一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解,而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果,所以RNA的制备与分析操作难度极大。 在实验中,一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不0载体 在Cohen和Boyer的实验中,两种质粒都能在E. coli中复制。因此,这两种质粒都可以作为载体,使重组DNA得以复制。所有基因克隆实验都需要这样的载体,我们称之为载体(Vector),但典型的基因克隆实验只涉及一个载体,以及一个依赖于载体进行复制的外源DNA片段。外源DNA没有复制起点,即DNA复制开始的地方,因此除非将其放入具有复制起点的载体中,否则它无法复制。自20世纪70年代中期以来,已经开发了许多载体;这些载体分为两大类:质粒(pl00你还在为动物造模没有成功而苦恼吗,看过了,跟小编一起学习吧,手把手教学 模式动物品系:SPF级Wistar大鼠,健康,2weeks,雌雄各半,体重为150g-180g。 实验分六组:正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组低、中、高剂量组。 实验周期:4-6 weeks 建模方法: 取2周龄雄性SD大鼠,喂饲呋喃唑酮,按0. 2mg/g体重的剂量,每周按体重调整一次用药剂量,共10周;另取正常对照组为单纯母乳喂养及正常饲料作为对照。观察指标包括:①心电图检测:记录Ⅰ00摘眼球采血:此法常用于鼠类大量采血。采血时,用左手固定动物,压迫眼球,尽量使眼球突出,右手用镊子或止血钳迅速摘除眼球,眼眶内很快流出血液。0分子克隆实验——无缝克隆 今天和大家讲讲无缝克隆常见的问题以及解决方法。 1.平板上很少或者没有克隆菌落 建议使用试剂盒附带的阳性对照,可排除试剂盒本身的影响。进一步判定,主要有以下可能的情况和建议: 01载体制备 线性化载体和插入片段的纯度不够,抑制反应。 02插入片段制备 1、引物设计不正确:同源臂15~25nt(不计算酶切位点),CG含量40~60%。 2、线性化载体和插入片段的纯度不够,抑制反应。若线性化载体与插入片段已经过纯化,00动物品系:成年健康大鼠 实验分组:正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组低、中、高三个剂量组 实验周期:N 建模方法:提起大鼠尾巴,置入小笼中。倒出适量乙醚于纱布上,置入鼠笼内,盖紧笼盖。待大鼠麻醉后取出,补充氯胺酮75~100mg/kg(ip)持续麻醉;阿托品20~30μg/kg腹腔注射,减少气道分泌物。固定大鼠仰卧于手术台上。剪除颈部及胸部被毛。纵形剪开颈部皮肤约1.5~2cm,分离皮下组织及肌肉。显露气管及其上甲状腺腺体。于腺体后0动物造模--骨质疏松小鼠模型 动物品系:SPF级C57BL/6鼠,健康,雌性未孕,6~8周,体重为18g~20g 实验分组:正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组 实验周期:12 weeks 建模方法: 小鼠3%腹腔麻醉后仰卧,腹部脱毛。在无菌条件下于腹股沟水平沿腹中线剪开皮肤及肌层,暴露腹腔。分离子宫并摘除卵巢,清理伤口后分两层缝合皮肤及基层,待小鼠清醒后,将其放回洁净笼具后放回饲养室饲养,定期观察小鼠状态及死亡情况并做好记录。术后3天,每只小01、蛋白样品不能反复冻融; 2、蛋白样品应加蛋白酶抑制剂,以增加蛋白的稳定性(建议最好能多加几中种蛋白酶抑制剂); 3、细胞水平要做Western Blot,一般地5×106个细胞提取的蛋白够就足Western Blot; 4、如果目标蛋白是膜蛋白和胞浆蛋白,所用的去垢剂就要温和得多,建议提取后最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性; 5、若转膜不完全,可以加大上样量,还有转移时你可以用降低电流延长时间,转膜液中甲醇的比例多加5-10%; 6、如果上样量超载,