相比于预制的梯度凝胶，在自制的固定浓度凝胶中，预染蛋白质分子量标准的条带会看起来显得略粗一些，而不如前者锐利。当条带较粗的时候，我们的实践经验显示，分子量的参考一般应以条带的上半部为准。 有些小伙伴的WB结果参照蛋白Marker，与预期大小不符，第一反应就是Marker不准。那么除了我们之前分析的预染蛋白Marker本身的准确性的问题，还有没有其他原因呢？ SDS-PAGE凝胶电泳按照分子量大小将蛋白分离，是蛋白在充分变性、还原条件下，

预染蛋白Marker，染料的标记反应和蛋白质的其它标记反应一样，其实际标记效率由于各种各样的因素而波动于一个合理的区间，不是一个确定的常数。在预染蛋白Marker的生产过程中，染料标记效率的波动将直接影响到最终标记产物的分子量大小。因此厂商都有一套优化的条件来实现相对稳定的染料标记效率。即使如此，标记效率的稳定性仍然不可能达到一个稳定的常数，仅能将其控制在一个比较小的波动范围。其结果是，染料标记的蛋白质产物的分子

预染蛋白Marker，又分单色预染Marker、双色预染Marker，多色预染Marker。如图： 单色预染蛋白Marker通常会加深某些条带的粗细，方便我们快速记忆和区分各个条带的大小。而彩色蛋白Marker则用不同的颜色，更加方便记忆区分。 除了上面介绍的，市面上还有一些其他类型的蛋白Marker：如显影蛋白Marker等。 显影蛋白Marker，蛋白条带中含有lgG结合位点，lgG结合位点会结合用于检测靶蛋白的一抗或二抗，使得蛋白Marker在印迹膜上可与目的条带一同呈现。

目前最常用的蛋白Marker分为非预染蛋白Marker、预染蛋白Marker。 *非预染蛋白Marke 是几种已知分子量并纯化好的蛋白质预混液。非预染Marker在电泳过程中看不到，电泳结束后经过蛋白染色后才能起指示作用，无法在实验过程中起预示作用。但是由于蛋白没有附带染料分子或者是标记分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，所以最准确。 *预染蛋白Marker 是纯化好的几种蛋白，通过与染料共价耦联后混合在一起，在电泳过程中或者转膜时可以直接观察到的一

关于SDS-PAGE 蛋白电泳的常见问题分析 1. 关于凝胶的一些问题 1. 胶的凝结不好，例如有花纹特别是浓度高的胶在冬天温度较低的情况下，在分离胶的下部有波浪样的花纹，凝胶不均匀。解决方法：加大 TEMED 和过硫酸胺的量，使其凝结速度加快。同时洗干净玻璃板，防止有残留的胶干结在玻璃板上。 2. 胶不凝，解决方法：温度较低时加大 TEMED 和过硫酸胺的量，过硫酸胺必须新鲜配制。如若还是不行重新配制一下缓冲溶液。 3. 胶易碎，例如浓度较高的胶

在处理组织的时候，为什么要用预冷的等渗缓冲液洗涤？等渗缓冲液是什么物质？

蛋白转膜的时候需要加甲醇么？

我的样本是糖尿病患者的创面、创面旁组织，在使用BCA测定样本蛋白含量，并调整后，可是WB结果显示内参actin始终不整齐。 因临床样本比较珍惜，特咨询一下。 猜测会不会是样本溶血原因？ 或者是不是其它原因？有知道的朋友帮忙回复下，谢谢！

从结果倒推操作过程中可能的问题，总的来说，WB结果不理想，可能的问题主要集中在以下几方面部分： 1、阴性结果的原因 1) 二抗条件过低：提高二抗浓度、延长二抗孵育时间或孵育温度 2) 一抗条件过低：提高一抗浓度、延长一抗孵育时间或孵育温度 3) 抗原过少：提高上样量 4) 抗体种属不兼容：一抗species reactivity中是否有需要检测样品的种属来源，一抗与二抗是否相匹配 5) 酶活性：二抗上标记的HRP或AP等酶活性降低，如抗体过期或反复化冻等 6) 封

B细胞是B淋巴细胞（Blymphocytes）的简称，因来源于鸟类法氏囊（bursa of Fabricius）和哺乳动物骨髓（bone marrow）而得名。B细胞也是免疫系统重要的免疫细胞，主要功能是介导体液免疫。B细胞还是重要的抗原递呈细胞，能摄取、加工和递呈抗原，同时还能分泌细胞因子（如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IFN、TGF-β、TNF、LT等）调节免疫应答。哺乳动物B细胞来源于骨髓干细胞，在骨髓中分化成熟。一旦成熟，B细胞就离开骨髓，到外周免疫器官的非胸腺依赖区定居，亦

4-1BB因子，即CD137，属肿瘤坏死因子受体超家族成员(TNFRSF9)，主要表达于活化的T细胞，是T细胞协同刺激分子，其配体为4-1BBL，二者结合可刺激T细胞（和B细胞）活化和增殖。

UniProtKB英文全称UniProt Knowledgebase（UniProt知识库） 主要由两部分组成：UniProtKB/Swiss-Prot（包含检查过的、手工注释的条目）和 UniProtKB/TrEMBL （包含未校验的、自动注释的条目）。

英文名 中文名 三字母缩写 单字母缩写 结构式 Alanine 丙氨酸 Ala A CH3-CH(NH2)-COOH Arginine 精氨酸 Arg R HN=C(NH2)-NH-(CH2)3-CH(NH2)-COOH Asparagine 天门冬酰胺 Asn N H2N-CO-CH2-CH(NH2)-COOH Asparagicacid 天门冬氨酸 Asp D HOOC-CH2-CH(NH2)-COOH Cysteine 半胱氨酸 Cys C HS-CH2-CH(NH2)-COOH Glutamine 谷氨酰胺 Gln Q H2N-CO-(CH2)2-CH(NH2)-COOH Glutamicacid 谷氨酸 Glu E HOOC-(CH2)2-CH(NH2)-COOH Glycine 甘氨酸 Gly G NH2-CH2-COOH Histidine 组氨酸 His H *NH-CH=N-CH=*C-CH2-CH(NH2)-COOH Isoleucine 异亮氨酸 Ile I CH3-CH2-CH(CH3)-CH(NH2)-COOH Leucine 亮

体液免疫和细胞免疫：由抗体一类可溶性分子介导的免疫应答称为体液免疫；由免疫细胞主要是T细胞介导的免疫应答称为细胞免疫。 免疫系统启动的是体液免疫还是细胞免疫取决于入侵病原体的种类和入侵途径。对于细胞外病原体，免疫系统可以直接进行清除或直接中和其产物（如毒素），其中抗体起重要作用；对付细胞内病原体，免疫系统往往动员T细胞，或者直接杀灭受感染的细胞（细胞毒性）；或者通过释放细胞因子激活其他细胞（如巨噬细胞

补体（complement）是一组血浆蛋白质，约有20余种，对热不稳定，可通过56℃处理30min而去除其活性。补体可协助抗体清除病原体并由此而得名。自然条件下，补体成分以无活性的酶原形式存在，多种特异性和非特异性免疫学机制可使这些无活性的酶原分解，产生一个有活性的大单位和一个小片段（小单位），这一过程称为激活。所得到的大片段通常停留在病原体和细胞表面，最终使后者裂解或加速其清除；小片段离开细胞表面，介导炎症反应。 （一）

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